FRET肽技術

熒光共振能量(liang)轉(zhuan)移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

熒(ying)光共(gong)振能(neng)量(liang)轉移（FRET)是一種(zhong)非輻射能(neng)量(liang)躍(yue)遷，通(tong)過(guo)分(fen)(fen)子(zi)間的(de)電偶(ou)極相(xiang)互作用(yong)，將供(gong)體激發態能(neng)量(liang)轉移到(dao)受體激發態的(de)過(guo)程。此過(guo)程沒有光子(zi)的(de)參與，所以是非輻射的(de)。該分(fen)(fen)析(xi)方法具(ju)有快速、敏感和簡單等優點。

用于FRET試驗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)染(ran)料是(shi)(shi)可(ke)以相同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。但(dan)在大多數應用中其實是(shi)(shi)使用不同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)染(ran)料。簡單地(di)說，熒(ying)光(guang)(guang)共振能(neng)(neng)量(liang)轉移(yi)是(shi)(shi)在供體基團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)激發狀態下由(you)(you)一對偶極(ji)子介導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)能(neng)(neng)量(liang)從供體(染(ran)料1)向受(shou)(shou)體(染(ran)料2)轉移(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)過程。通常(chang)，供體 （Donor）熒(ying)光(guang)(guang)基團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發射(she)光(guang)(guang)譜要與受(shou)(shou)體（Acceptor）基團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸收光(guang)(guang)譜有一定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重疊。當這兩個熒(ying)光(guang)(guang)基團間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)距(ju)離合(he)適時（10 – 100 ?)），就可(ke)觀察到熒(ying)光(guang)(guang)能(neng)(neng)量(liang)由(you)(you)供體向受(shou)(shou)體轉移(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)現象。能(neng)(neng)量(liang)轉移(yi)發生方式依賴于受(shou)(shou)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)學(xue)結構：


  • a) 被轉化為分子的振(zhen)動，即發生能(neng)量轉移熒(ying)光熄(xi)滅。(受體是(shi)猝光劑)
  • b) 發射更(geng)強于(yu)受體(ti)(ti)本(ben)身的特征熒光，造成(cheng)次級熒光光譜(pu)的紅(hong)移。 (受體(ti)(ti)是熒光發射體(ti)(ti))。


FRET Overview: EDANS and Dabcyl

一(yi)個供體基團（EDANS）和接(jie)(jie)受基因（DABCYL）勻被(bei)(bei)連接(jie)(jie)到(dao)一(yi)HIV蛋白(bai)酶(mei)的天然底物(wu)上，當該(gai)底物(wu)未被(bei)(bei)切斷時，DABCYL可(ke)淬滅(mie)EDANS，從而檢(jian)測不(bu)到(dao)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)。當該(gai)底物(wu)被(bei)(bei)HIV-1蛋白(bai)酶(mei)切斷后，EDANS不(bu)再(zai)被(bei)(bei)DABCYL淬滅(mie)，隨即可(ke)檢(jian)測到(dao)EDANS熒(ying)(ying)光(guang)(guang)。蛋白(bai)酶(mei)抑制劑的有效性可(ke)憑借(jie)EDANS熒(ying)(ying)光(guang)(guang)強度的變化進行監測。

FRET Peptide synthesis: EDANS and Dabcyl

FRET肽(tai)(tai)是(shi)研究肽(tai)(tai)酶特(te)異性的便(bian)利(li)工具，由于其反(fan)應過程可被連續監(jian)測(ce)(ce)，為(wei)酶活性的檢測(ce)(ce)提供(gong)了一(yi)個便(bian)捷的方法。供(gong)體/受體對(dui)(dui)的肽(tai)(tai)鍵水解(jie)后產生的熒(ying)光(guang)(guang)可衡(heng)量納摩爾(er)級濃度的酶活性。當FRET肽(tai)(tai)是(shi)完(wan)整的，表現出的是(shi)內(nei)部的熒(ying)光(guang)(guang)猝滅，但當供(gong)體/受體對(dui)(dui)的任何肽(tai)(tai)鍵斷裂就會釋放(fang)出熒(ying)光(guang)(guang)，此熒(ying)光(guang)(guang)可被連續檢測(ce)(ce)，從而可對(dui)(dui)酶的活性進行(xing)定量分析。

FRET 肽可作為(wei)各類酶研究的合適底物(wu)，比(bi)如：


  1. 肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的(de)動力特(te)征(zheng)和功能特(te)征(zheng)。
  2. 對新的(de)蛋白水解酶的(de)篩(shai)選和檢測。
  3. 對多肽折(zhe)疊的構象研究。


以下(xia)是(shi)一些用(yong)于FRET的標準(zhun)染料組合::


  1. Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
  2. Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
  3. Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP): MCA/Lys(Dnp).
  4. Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp): Abz/Tyr (NO2), Abz/EDDnp
  5. Dabcyl and Glu(EDANS)


在蛋(dan)白酶的(de)多肽底(di)物內經共振能量轉(zhuan)移引發(fa)熒(ying)光(guang)猝滅的(de)供體-接受對

 

波長(nm)

猝滅劑

熒光團

激(ji)發波

發(fa)射波(bo)

Dabcyl
Dansyl
DNP
DNP
DNP
Tyr (NO2)

Edans
Trp
Trp
MCA
Abz
Abz

336
336
328
328
328
320

490
350
350
393
420
420



常(chang)規RET供(gong)體-接受對(dui)的福(fu)斯(si)特(te)臨界距離（Forster Critical Distance）

Donor

Aceptor

Forster Distance
(Nanometers)

Tryptophan
IAEDANS (1)
BFP
Dansyl
Dansyl
CFP
CF (3)
Fluorescein
Cy3
GFP
BODIPY FL (4)
Rhodamine 6G
FITC
B-Phycoerythrin
Cy5

Dansyl
DDPM (2)
DsRFP
FITC
Octadecylrhodamine
GFP
Texas Red
Tetramethylrhodamine
Cy5
YFP
BODIPY FL (4)
Malachite Green
Eosin Thiosemicarbazide
Cy5
Cy5.5

2.1
2.5-2.9
3.1-3.3
3.3-4.1
4.3
4.7-4.9
5.1
4.9-5.5
>5.0
5.5-5.7
5.7
6.1
6.1-6.4
7.2
>8.0

(1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
(2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene