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熒光標記

熒光修(xiu)飾可以通過共價鍵的(de)形式連接在多肽序列的(de)N端(duan)或C端,但是更推薦在N端進行修飾。 以下為合(he)生(sheng)(sheng)生(sheng)(sheng)物(wu)常用(yong)熒光

修飾(shi)以及發光顏色。

熒光標記肽結合成像技(ji)術后可用于識別特定靶點。共聚焦或(huo)熒光顯微(wei)鏡的體外成像仍然是研究細胞內各(ge)種生物過程和(he)相

互作用十分有效的方法(fa)之(zhi)一。與(yu)蛋白質不同,這些(xie)肽(tai)定(ding)(ding)位于肌動蛋白上的特定(ding)(ding)靶點,不易聚集蛋白質,因(yin)此非常適合于

體外跟蹤。同(tong)樣(yang),FITC標記的CPP也可被(bei)用(yong)于細胞內組分(fen)的成像,且其細胞毒性低。

其(qi)中,FITC 是一種胺活(huo)性的熒光染料,可(ke)廣泛的用于(yu)標記(ji)多(duo)肽(tai)和蛋白質。合生(sheng)(sheng)生(sheng)(sheng)物(wu)在N端(duan)標記(ji)Fitc,都(dou)會建議(yi)在后(hou)面一

個氨基和(he)由(you)異硫(liu)氰酸酯(zhi)與氨基反應產生的硫(liu)脲鍵(jian)之間(jian)引入烷基間(jian)隔器(alkyl spacer)如氨基己酸(Ahx)。鏈接切割

需要酸(suan)性環境,在N端標記FITC的多(duo)肽需經歷(li)環(huan)化作用來形成(cheng)熒(ying)光素,通常會伴有后面一(yi)個(ge)氨(an)基酸的去(qu)除(chu),但當有一(yi)個(ge)

間(jian)(jian)隔(ge)器(qi)如氨基(ji)己(ji)酸,或者是(shi)通(tong)過非酸性環境將目的(de)肽從(cong)樹脂上(shang)切(qie)下來(lai)時,這種(zhong)情(qing)況可避(bi)免。空間(jian)(jian)位阻(zu)被(bei)認為是(shi)在(zai)熒(ying)光染

料前使用Ahx的主要原(yuan)因,而(er)不(bu)是為什么FITC不能直接偶聯(lian)在多肽上的原因。


下圖是合生生物經典案(an)例之一:

合(he)成FITC-Ahx-RAKWNNTLKQIASK的MS&HPLC圖譜


對于較長的序列,建議(yi)使用 FRET pairs (fluorescence resonance energy transfer pairs)進行修飾(shi)。 

熒光(guang)共振能量轉移(FRET)是描(miao)述兩個熒光團之間的能量轉移的機制。由于(yu)FRET效率部分(fen)基于供體和受體分(fen)子(zi)之(zhi)間(jian)的

距離,因此該技術(shu)通常用于研究酶效率,蛋(dan)白質 - 蛋白質(zhi)相互(hu)作用或其(qi)他分子(zi)動(dong)力學。

圖1.蛋白酶(mei)研究的(de)FRET機制。

(當肽保持完整時(shi),受(shou)(shou)體分子(zi)將(jiang)淬滅(mie)供體分子(zi),并且不(bu)會檢測到(dao)熒光。如果序(xu)列(lie)被(bei)蛋白酶活性切割,則(ze)受(shou)(shou)體將(jiang)不(bu)再淬滅(mie)

供體,并且(qie)將檢測(ce)到熒光信號)

FRET肽是(shi)研究肽酶特異性(xing)的便利工具(ju),由(you)于其反應過(guo)程可被連(lian)續監測(ce),為酶活(huo)性(xing)的檢(jian)測(ce)提供(gong)了一個便捷的方法。

供體/受(shou)體對(dui)的(de)肽鍵水解后產生(sheng)的(de)熒光可衡量納摩爾級濃度的(de)酶活性。當FRET肽是(shi)完整的(de),表現出的(de)是(shi)內(nei)部的(de)熒光猝

滅,但當供(gong)體/受體對的(de)任何(he)肽鍵斷裂就會釋放出(chu)熒(ying)光,此熒(ying)光可(ke)被連續檢測,從(cong)而可(ke)對酶的(de)活(huo)性進行定量分(fen)析。

FRET 肽可作為各類(lei)酶研究的合適底(di)物,比如(ru):

1. 肽酶、蛋白酶、激(ji)酶、磷(lin)酸酶的動力(li)特(te)征(zheng)和(he)功能特(te)征(zheng)。

2. 對新的蛋白(bai)水解(jie)酶的篩選和(he)檢測。

3. 對多肽折疊的構象研究。


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