1)多肽穩定(ding)性(xing)
關于多肽的一個常見的誤解是多肽像蛋白質一樣是不穩定的。事實上,多肽比蛋白質穩定得多,由于兩個影響蛋白質穩定性的要素不存在多肽合成中。這兩個要素(su)是第三(san)次折疊和蛋(dan)白(bai)酶的(de)污染。
蛋(dan)白質(zhi)很(hen)容易變性,由(you)于它的(de)三級構造是由(you)非共(gong)價鍵聯(lian)合的(de),例如靜電互(hu)相作(zuo)用和(he)疏水互(hu)相作(zuo)用。多(duo)肽的(de)長度和(he)蛋(dan)白質(zhi)相比是很(hen)短;所以大多(duo)數肽沒有(you)足夠量(liang)達到這(zhe)種(zhong)互(hu)相作(zuo)用使之出現第三次折疊。故多(duo)肽不能像蛋(dan)白質(zhi)一樣變性。
多(duo)肽(tai)只能經過共價修飾或者肽(tai)鍵(jian)斷(duan)裂被毀(hui)壞(huai)。不像蛋白質(zhi)是(shi)(shi)(shi)從充溢各種蛋白酶的細(xi)胞里被純化(hua),合成的多(duo)肽(tai)被蛋白酶污(wu)(wu)染(ran)的幾率是(shi)(shi)(shi)很(hen)(hen)小(xiao)很(hen)(hen)小(xiao)的。昂(ang)拓(tuo)萊(lai)司生物在試(shi)驗中(zhong)發現在中(zhong)性pH條件(jian)下,大多(duo)數生物實(shi)驗的停(ting)止速(su)度很(hen)(hen)慢。中(zhong)性條件(jian)下細(xi)菌(jun)污(wu)(wu)染(ran)可能是(shi)(shi)(shi)一個嚴重(zhong)的問題(由于多(duo)肽(tai)是(shi)(shi)(shi)細(xi)菌(jun)的一種良好的營養源)。因次(ci),實(shi)驗里用到的溶劑過濾完全比多(duo)肽(tai)的穩定更(geng)重(zhong)要。
在正常條件下,多肽溶(rong)液在室溫下能保管幾天,在4度保管幾個星期和在-20度保管若干個月或更多;凍干的多(duo)肽粉末在(zai)室溫下能保管(guan)幾(ji)個月,在(zai)-80度下保管(guan)幾(ji)年(nian)。
2)多(duo)肽濃度
準確測定多肽濃度(du)比許多人(ren)預期的要(yao)復雜。事實上(shang),沒有一個(ge)簡單的通用辦(ban)法能用。
稱重(zhong)和紫外線吸(xi)收力是兩(liang)個常(chang)用(yong)的辦法(fa)。
a. 稱重(zhong)。 它(ta)只能提供粗略估量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)多(duo)肽含(han)量(liang)(liang)(liang)。多(duo)肽粉末是不容易(yi)處置的(de)(de)。要準確稱(cheng)量(liang)(liang)(liang)少(shao)量(liang)(liang)(liang)(<3毫克)是一個問題(ti)。另(ling)一個問題(ti)是,肽能夠含(han)有各(ge)種含(han)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)水和即便被大范(fan)圍凍干后含(han)有的(de)(de)較少(shao)水平(ping)的(de)(de)反離(li)子。水的(de)(de)的(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)范(fan)圍從約5%至20%,有的(de)(de)以至> 40%。昂(ang)拓萊司生(sheng)物試(shi)驗(yan)中(zhong),實(shi)計(ji)含(han)量(liang)(liang)(liang)取決于(yu)(yu)多(duo)肽序列。反離(li)子的(de)(de)類型和數量(liang)(liang)(liang)取決于(yu)(yu)用于(yu)(yu)多(duo)肽純(chun)化的(de)(de)溶(rong)劑和多(duo)肽序列。這些水分子產(chan)生(sheng)的(de)(de)不肯定性是不能被疏忽。
b. 紫外(wai)線吸收性。假如(ru)您的(de)多(duo)肽(tai)含有一個酪(lao)氨(an)酸或色氨(an)酸殘基,多(duo)肽(tai)的(de)定量剖(pou)析(xi)就變得愈加(jia)簡單(dan)。
色(se)氨(an)酸在(zai)282 nm處的(de)摩(mo)(mo)爾(er)(er)吸(xi)(xi)光(guang)度[1 /(M *厘米)]是(shi)5700,酪(lao)(lao)氨(an)酸在(zai)在(zai)275 nm處的(de)摩(mo)(mo)爾(er)(er)吸(xi)(xi)光(guang)度是(shi)1400。在(zai)0.1N的(de)NaOH中,酪(lao)(lao)氨(an)酸的(de)-OH基團充沛去質子化。這就(jiu)使酪(lao)(lao)氨(an)酸的(de)吸(xi)(xi)收(shou)峰(feng)為293納米。在(zai)此條(tiao)件下,它的(de)摩(mo)(mo)爾(er)(er)吸(xi)(xi)光(guang)度增加到2400。值得關(guan)注的(de)是(shi),假如(ru)肽的(de)側鏈之間有互相作用,紫外線吸(xi)(xi)收(shou)率能夠不同。
這在(zai)小的(de)親水(shui)(shui)性(xing)肽(tai),這不(bu)(bu)是(shi)(shi)問題。在(zai)水(shui)(shui)溶(rong)液中,這些肽(tai)通常采用(yong)伸展(zhan)構象,一切(qie)的(de)側(ce)鏈(lian)是(shi)(shi)完(wan)(wan)整暴露(lu)于(yu)溶(rong)劑(ji)中的(de)。但關于(yu)長的(de)疏水(shui)(shui)性(xing)多(duo)肽(tai),昂拓萊司生物試驗發現這種假定是(shi)(shi)不(bu)(bu)完(wan)(wan)整正確的(de)。有(you)時可(ke)察看到低水(shui)(shui)平聚合(he)和折疊。出于(yu)這個緣由,我們(men)以為,酪氨酸(suan)在(zai)0.1N NaOH中,在(zai)293 nm處的(de)吸光度是(shi)(shi)*好的(de),由于(yu)在(zai)此條件(jian)下,肽(tai)是(shi)(shi)完(wan)(wan)整變(bian)性(xing)的(de)。它獨一的(de)缺陷是(shi)(shi),用(yong)于(yu)濃度測定的(de)樣品不(bu)(bu)能被恢復。
假如(ru)您的肽(tai)不含有(you)色氨酸(suan)或酪氨酸(suan),**理解(jie)肽(tai)的濃(nong)度是至關重要的,獨(du)一合理的選擇是氨基酸(suan)定量剖析。當然,這超出大多數實驗室的日常(chang)操作。
基于(yu)上面的討(tao)論,為(wei)了(le)多肽(tai)的濃(nong)度的準(zhun)確(que)測定,我們激烈(lie)倡(chang)議在你(ni)的多肽(tai)的N-或(huo)C-末(mo)端添加(jia)一個酪氨酸殘基。
3)N-末端乙酰(xian)化(hua)和的C-末端酰(xian)胺化(hua)
人們經常以為用乙酰(xian)基和(he)酰(xian)胺基分(fen)別阻斷肽(tai)的(de)兩端能增(zeng)加肽(tai)的(de)穩定性,實踐上這是不正確的(de)。
大(da)多(duo)數合(he)成(cheng)肽的(de)序列都來(lai)源于(yu)蛋白質片(pian)段。在一個蛋白質中,多(duo)肽序列的(de)N末(mo)端(duan)(duan)和C末(mo)端(duan)(duan)構成(cheng)肽鍵。這不(bu)(bu)同于(yu)合(he)成(cheng)肽含(han)有(you)不(bu)(bu)帶電荷的(de)兩端(duan)(duan)。帶電荷和不(bu)(bu)帶電荷的(de)多(duo)肽的(de)物(wu)理(li)化學性質是(shi)完(wan)整不(bu)(bu)同的(de),反過(guo)來(lai)這些性質又影響多(duo)肽的(de)功(gong)用(yong)。經過(guo)乙酰(xian)基和酰(xian)胺基分(fen)別(bie)封鎖N端(duan)(duan)和C端(duan)(duan),這些問題能(neng)夠被處理(li),并且能(neng)夠使合(he)成(cheng)肽的(de)兩端(duan)(duan)更像肽鍵。由(you)于(yu)這個緣(yuan)由(you),昂拓萊司生(sheng)物(wu)用(yong)于(yu)抗體試驗的(de)多(duo)肽是(shi)末(mo)端(duan)(duan)封鎖的(de),除(chu)非抗原位于(yu)蛋白的(de)末(mo)端(duan)(duan)。由(you)于(yu)相同的(de)緣(yuan)由(you),我們倡(chang)議顧客在停止(zhi)其它功(gong)用(yong)性研(yan)討(tao)時(shi)封鎖合(he)成(cheng)肽的(de)兩端(duan)(duan)。沒有(you)理(li)論支持(chi)有(you)自在端(duan)(duan)的(de)多(duo)肽是(shi)不(bu)(bu)穩定的(de)。
4)多肽(tai)溶(rong)解度
當試圖將多肽溶解在執行多肽生物功用的溶液中時,溶解度成為關注的焦點。一切的多(duo)肽都能溶解在有機溶劑(ji)中。但是這(zhe)并沒有多大的協助,由于大多數肽的研討不能再有機溶(rong)劑中進行。
肽的溶(rong)解(jie)度*終取決于它的序列。在(zai)能(neng)(neng)夠操作的條件,pH值可能(neng)(neng)是(shi)*重要的。昂拓萊司(si)生物發(fa)現,在(zai)許(xu)多狀(zhuang)況下,改動(dong)1-3個pH值單位(wei)能(neng)(neng)夠使十分穩定的多肽完整溶解。過渡曲(qu)線通常是(shi)很(hen)峻峭的。在(zai)一個很(hen)窄的pH范(fan)圍(wei)內,溶液從混(hun)濁(zhuo)變得明澈。這(zhe)可能(neng)(neng)是(shi)由于某些殘基電離狀(zhuang)態(tai)的改動(dong),比(bi)方His。
還(huan)有另(ling)一個緣由使(shi)pH值調整變得(de)重要(yao)。由于用于肽純化的HPLC溶劑含有0.1%的不能經過凍干徹底除去(qu)的TFA,收到的多肽通常(chang)含有少量的TFA。從(cong)而使(shi)得(de)肽溶液比你預期的更具(ju)有酸性。
關于難以(yi)溶(rong)解(jie)的(de)肽,你能(neng)夠(gou)在(zai)有機(ji)溶(rong)劑中制備(bei)更高濃度的(de)原(yuan)液,例(li)如DMS,并且在(zai)生物(wu)功用(yong)檢測(ce)期(qi)間稀(xi)(xi)釋肽。大多數的(de)檢測(ce)能(neng)包容1-2%的(de)DSMO,一(yi)些以(yi)至(zhi)是5%。但是這并不是總是起作(zuo)用(yong)的(de)。一(yi)些肽當從DMSO中稀(xi)(xi)釋時以(yi)至(zhi)在(zai)更低濃度時匯集和沉淀。